Full svullnad av hartset
Väg 2,0 g blank Wang-harts i ett rent och torrt reaktionsrör, tillsätt 15 mL DMF, rumstemperaturaktivering ca 30 min.
Ta den första aminosyran
Vid rumstemperatur, filtrera bort lösningsmedlet från föregående steg genom en sandkärna och tillsätt 1 mmol 5 molärt överskott C Första aminosyran i slutet, 5-faldigt molärt överskott DMAP, 5 molärt överskott DIC, DMF Gör lösningsmedel rumstemperaturreaktion 3 timmar. Använd efter att reaktionen är klar DMF-tvätt 4 ~ 6 gånger, 5-6 gånger varje gång ml. Tillsätt sedan en lämplig mängd pyridin och ättiksyraanhydrid med ett volymförhållande av 1:1 och reagera i 30 min. Använd efter att reaktionen är klar DMF-tvätt 4 ~ 6 gånger, 5-6 gånger varje gång ml. (effekt: Blockera de aktiva mikroprickarna på det oreaktiva tomma hartset.)
Fmoc Avgång av skyddsgrupper
Ta bort lösningsmedlet från föregående steg genom sugfiltrering, och tillsätt 10 mL 20% piperidin DMF Lösningen tillsätts till hartset, N2 Rör 10 min Slutligen filtrera lösningen och tillsätt 10 mL 20% piperidin DMF-lösning, N2 Blås och rör om 5 min Filtrera sedan ut lösningen och upprepa denna operation två gånger. DMF Tvätta 4 gånger, tvätta 2 gånger med metanol, 5-6 gånger varje gång ml.
Testa borttagningseffekten av ninhydrin
Ta ut en liten mängd harts, tvätta den tre gånger med metanol, tillsätt ninhydrin, KCN, En droppe vardera fenollösning, 105 grader –110 grader Uppvärmning 5 min, Att bli mörkblå är en positiv reaktion, vilket indikerar att borttagningen är klar och nästa steg av reaktionen kan utföras.; Om den är färglös betyder det att skyddsgruppen inte har avlägsnats fullständigt, och ovanstående avskyddningsoperation måste upprepas.
Sedan den andra aminosyran och Fmoc Protection-gruppen borttagning
Väg 3 gånger molärt överskott C Den andra aminosyran i slutet, ett 3-faldigt molärt överskott av HBTU och ett 3-faldigt molärt överskott av HOBT I reaktionsröret, tillsätt lämplig mängd DMF Efter att lösningen är helt upplöst, tillsätt ett 10-faldigt molärt överskott (ren) DIEA, rumstemperaturreaktion 40 min, använd DMF-6 gånger Tvätt, 4-6 gånger varje gång. Ta en liten mängd harts användning Testa med ninhydrin detektionsreagens och det kommer att se färglöst ut, tillsätt sedan 10 mL 20% av piperidin DMF Solution avlägsnande Fmoc, Gör detta två gånger i 10 min, 5 min, efter användning DMF Tvätta 4 gånger, tvätta 2 gånger med metanol, 5-6 gånger varje gång ml. Ta ut en liten mängd harts. Använd ninhydrindetektionsreagenset för att detektera det. Om detektionen är blå kan du gå vidare till nästa steg i reaktionen.
I analogi, upprepa steg 2.6 tills syntesen är N Ta bort den sista aminosyran i slutet av Fmoc Protect-basen och dränera sedan.
Hartsavfall och ren produktseparation och detektering
Använd slutligen trifluorättiksyraskärlösning (95% TFA:2% TIS:2% EDT:1% H2O) Klipp 2 timmar, filtrera reaktionslösningen med sug och erhåll en trifluorättiksyralösning av polypeptiden. Torka lysatet med kväve så mycket som möjligt, fäll ut med eter, centrifugera och tvätta sedan med eter i 3 sekunder. ~5 gånger erhölls ett vitt fast material. Efter att ha löst det i rent vatten, HPLC Avsalta och rena, frys-torka och fälla ut kristaller, ta en liten mängd MS-analys.